Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia p�ISSN:
2541-0849
e-ISSN:
2548-1398
Vol.
7, No. 6, Juni 2022
UJI IN SILIICO
SENYAWA EDCS (ENDOCRINE DISRUPTING
CHEMICALS) DAN PHLOROGLUCINOL TERHADAP RESEPTOR ESTROGEN
Diar Herawati, A.A Hidayat, Amir Musadad
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Islam Bandung, Indonesia
Email: [email protected], [email protected] [email protected]
Abstrak
Bisphenol-A merupakan salah satu
dari Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs)
yang terdapat pada bahan baku plastik salah satunya polycarbonate (PC). BPA lepas
dari polimer akibat proses pemanasan pada kemasan, sehingga residu terakumulasi dalam tubuh dan menginvasi sel-sel payudara dengan cara menguasai estrogen
receptor (ER) dan menyebabkan kanker
payudara. Phloroglucinol berpotensi
melawan pertumbuhan sel kanker payudara.
Penelitian ini dilakukan perbandingan afinitas ERβ tehadap BPA dan
phloroglucinol dengan metode
In silico. Makromolekul
ERβ diunduh dari Protein
Data Bank (PDB) (www.rcsb.org)
dengan kode (PDB ID : 3OLS). Struktur 2D BPA dan phloroglucinol
digambar menggunakan
program ChemBioDraw 2D 15.0 dan dioptimasi menjadi struktur 3D menggunakan program ChemBioDraw 3D 15.0. Senyawa
BPA dan phloroglucinol di-docking terhadap
ERβ menggunakan program MGL Tools 1.5.6
yang dilengkapi Autodock
Tools 4.2.6. Hasil docking menunjukkan nilai energi bebas
ikatan (∆G) phloroglucinol terhadap ERβ -4,67 Kkal/mol
dan BPA terhadap ERβ-7,70 Kkal/mol.
Nilai ∆G terbesar adalah
phloroglucinol, sehingga ikatan
senyawa dengan reseptor lemah dan mudah terurai oleh tubuh. Pengujian toksisitas antara BPA dan phloroglucinol
dilakukan menggunakan
program Toxtree 3.1.0. Hasil uji toksisitas menunjukan phloroglucinol
kategori Low (Class I) dan BPA kategori High (Class III) yang artinya
phloroglucinol aman sebagai
alternatif bahan baku plastik.
Kata Kunci: endocrine disrupting chemicals; phloroglucinol;
estrogen beta; in silico
Abstract
Bisphenol-A is one of the Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) found in
plastic raw materials, one of which is polycarbonate (PC). BPA is released from
the polymer due to the heating process on the packaging, so that the residue
accumulates in the body and invades breast cells by controlling the estrogen
receptor (ER) and causing breast cancer. Phloroglucinol has the potential to
fight the growth of breast cancer cells. This study was conducted to compare
the affinity of ERβ to BPA and phloroglucinol using themethod
In silico. ERβ macromolecules downloaded from
Protein Data Bank (PDB) (www.rcsb.org) with code (PDB ID: 3OLS).
2D structures of BPA and phloroglucinol were drawn using the program. ChemBioDraw 2D 15.0 and optimized into a 3D structure using
the program ChemBioDraw 3D 15.0. BPA and
phloroglucinol bedocking to ERβ using program MGLTools 1.5.6 incorporates AutodockTools 4.2.6. The results docking showed the value
of the free energy (∆G) of phloroglucinol against ERβ -4.67 Kcal/mol
and BPA against ERβ -7.70 Kcal/mol. The largest ∆G value is
phloroglucinol, so that the compound bonds with the receptors are weak and are
easily broken down by the body. Toxicity testing between BPA and phloroglucinol
was carried out using the program Toxtree 3.1.0.
Result Toxicity test shows phloroglucinol in the category Low (Class I) and the
category BPA High (Class III), which means that phloroglucinol is safe as an
alternative to plastic raw materials. Abstracts are made in two languages,
English and Bahasa Indonesia. Abstract more about background, purpose, up to,
the results of research, and manai research. Abstract
contains up to 250 words, single write spaces with italics (Italics) for
English abstracts. Below the abstract are listed keywords consisting of six
words, where the first word is again the forward. Abstract in Indonesian can be
a translation of an English translation. Tif editor for abstract syning for reasons of abstract content.
Keywords: bisphenol-a; phloroglucinol; beta
estrogen; in silico; plastic raw
materials
Pendahuluan
Plastik banyak
digunakan sebagai tempat untuk mengolah, menyimpan atau mengemas makanan. Dalam kehidupan
masyarakat sehari-hari penggunaan plastik semakin meningkat karena fleksibel,
tidak mudah pecah, bentuk laminasi, transparan, harganya relatif lebih murah,
praktis, dan lebih tahan lama. Namun plastik juga memiliki kelemahan, yaitu
tidak tahan panas dan dapat mencemari produk karena adanya migrasi komponen
monomer yang berakibat buruk terhadap kesehatan terutama bagi kaum wanita yang
dimana dapat menyebabkan kanker payudara.
Kanker payudara
adalah kanker dengan persentase kasus baru tertinggi hingga 43,3%� dan persentase kematian tertinggi hingga
12,9% pada wanita di dunia berdasarkan research
Globocan, International Agency for Research on Cancer (IARC) tahun 2012.
Penyebab utama kanker payudara yaitu adanya reseptor estrogen (ER) yang
merupakan salah satu marker klinis penting dalam kanker payudara. Salah satu
senyawa yang dapat menyebabkan kanker payudara adalah bisphenol-A (BPA) yang dimana sebagai bahan baku plastik.
Senyawa bisphenol-A (BPA) atau 2,2-bis(4-hydroxyphenyl) propane,
merupakan salah satu dari endocrine
disrupting chemicals (EDCs) yang dapat terakumulasi oleh tubuh akibat
residu dari polimer yang terdapat pada pengemas makanan dan minuman (Le,
Carlson, Chua, & Belcher, 2008).
Phloroglucinol merupakan oligomer penyusun phlorotannin yang dapat dihasilkan dari alga coklat Sargassum Duplicatum di mana senyawa
tersebut memiliki potensi sebagai efek inhibisi melawan pertumbuhan sel kanker
payudara MCF-7 melalui induksi apoptosis (Lazennec,
Bresson, Lucas, Chauveau, & Vignon, 2001). Salah satu pemanfaatan alga coklat
yang sering dilakukan adalah pembuatan plastik biodegradable.
Plastik biodegradable adalah plastik yang dapat
diuraikan kembali oleh mikroorganisme secara alami menjadi senyawa yang ramah
lingkungan. Salah satu cara untuk mengetahui manfaat alga coklat adalah
menggunakan metode in silico.
Pada penelitian
sebelumnya telah dilakukan oleh (Dwipratama & Effendi, 2017) dengan
menggunakan software ArgusLab�.
Hasil docking penelitian tersebut
menunjukkan bahwa nilai energi bebas ikatan (ΔG) Phloroglucinol dengan ER -6,91549 kkal/mol dan BPA dengan ER
-8,41162 kkal/mol yang dimana menjelaskan bahwa Phloroglucinol sangat berpotensi untuk dijadikan obat antikanker
payudara, sehingga dalam penelitian ini perlu dilakukannya pengujian toksisitas
menggunakan software Toxtree dan
metode docking lain menggunakan software Autodock.
Pada penelitian (Maryawan,
Effendi, & Fakih, 2020), didapatkan bahwa penggunaan software Autodock dan Toxtree dapat menggambarkan tingkat
keamanan dalam senyawa sehingga metode tersebut akan digunakan dalam penelitian
ini.
Berdasarkan uraian
di atas dapat dirumuskan masalah dalam penelitian ini yaitu apakah phloroglucinol dari alga coklat dapat
digunakan sebagai alternatif bahan baku plastik yang lebih aman dibandingkan bisphenol-A bagi kesehatan khususnya
bagi kaum wanita?
Tujuan dilakukannya
penelitian ini guna memaksimalkan pemanfaatan alga coklat dalam bidang farmasi,
terutama sebagai alternatif bahan baku plastik yang aman bagi kesehatan juga
ramah lingkungan, mengetahui afinitas dan toksisitas phloroglucinol dari alga coklat terhadap reseptor estrogen (ER)
yang dibandingkan dengan afinitas dan toksisitas bisphenol-A terhadap reseptor estrogen (ER) menggunakan metode in silico.
Metode Penelitian
Penelitian ini
dilakukan untuk membandingkan interaksi antara senyawa bisphenol-A terhadap
reseptor estrogen (ER) dengan
phloroglucinol terhadap
reseptor estrogen (ER). Metode
yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode in silico dengan tahapan
penggambaran struktur senyawa uji, optimasi geometri, pencarian struktur reseptor estrogen (ER), penambatan molekul, dan uji toksisitas senyawa. Adapun rincian tahap penelitian
sebagaimana berikut ini:
1) Menentukan jenis
reseptor estrogen mana yang berikatan
dengan bisphenol-A.
Penyebab kanker payudara secara spesifik disebabkan oleh adanya pengikatan bisphenol-A dengan
reseptor estrogen jenis
beta (ERβ), pada jalur pensinyalan
non-genomik Estrogen
Related Receptor jenis gamma (ERRγ).
2) Penggambaran struktur
dua dimensi (2D) dan struktur tiga dimensi
(3D) dari senyawa bisphenol-A dan phloroglucinol menggunakan software ChemBioDraw versi 15.0.
3) Pencarian dan pengunduhan
struktur tiga dimensi (3D) dari reseptor estrogen beta (Erβ) yang diunduh
pada website rcsb.org (Protein Data
Bank) dengan kode 3OLS.
4) Selanjutanya dilakukan
metode docking
pertama penghapusan molekul air, kemudian dipisahkan reseptor estrogen dengan ligan alami. Kemudian dilakukan preparasi meliputi penambahan atom hidrogen, penambahan muatan parsial Gasteiger charge lalu disimpan dalam
bentuk file
pdb.
5) Setelah struktur
reseptor telah diunduh, kemudian dilakukan validasi metode docking dengan menggunakan software MGL Tools versi
1.5.6 yang dilengkapi dengan
Autodock Tools versi
4.2.6, Kemudian dilakukan simulasi docking antara reseptor estrogen beta
(Erβ) dengan bisphenol-A
dan reseptor estrogen beta (Erβ) dengan phloroglucinol
menggunakan software
MGL Tools versi 1.5.6 yang dilengkapi
dengan Autodock Tools versi 4.2.6.
6) Hasil docking pada sisi binding site yang didapat dianalisis dengan menggunakan software
BIOVIA Discovery Studio Visualizer 2016. Penambatan
molekul antara bisphenol-A terhadap
reseptor estrogen beta (Erβ) dengan
phloroglucinol terhadap
reseptor estrogen (Erβ) (nilai
energi ikatan dan konstanta inhibisi) menggunakan software
BIOVIA Discovery Studio Visualizer 2016.
7) Uji toksisitas
senyawa bisphenol-A
dan phloroglucinol hasil optimasi geometri menggunakan software Toxtree
versi 3.1.0 untuk mengetahui potensi toksisitas senyawa dengan menggunakan parameter prediksi parameter Cramer
Rules, Benigni dan Bossa rulebase dan Kroes TTC decision
tree.
Adapun bahan
yang dibutuhkan dalam penelitian terdiri atas:
�
Struktur 2D Senyawa Bisphenol-A
Gambar 1
Struktur 2D Senyawa Bisphenol-A
�
Struktur 2D Senyawa Phlorogucinol
Struktur 2D Senyawa Phloroglucinol
�
Struktur
3D Reseptor Estrogen Beta (Er)
Gambar 3
Struktur 3D Makromolekul Reseptor Estrogen
Begitu pun dengan alat penunjang penelitian terdiri atas dua bagian,
yaitu perangkat keras dan perangkat lunak. Perangkat keras yang digunakan yaitu laptop dengan spesifikasi RAM (Random Access Memory) empat
gigabyte (4GB); Processor (Intel Core
i3-6006U CPU @ 2.00GHz (4 CPUs), [email protected];
dan sistem operasi Microsoft Windows 10. Sedangkan perangkat lunak yang digunakan adalah BIOVIA
Discovery Studio 2016; ChemBioDraw 2D versi 15.0; ChemBioDraw 3D versi 15.0; MGL Tools
versi 1.5.6-AutoDockTools
versi 4.2.6 dan Toxtree versi 3.1.0.
Hasil dan Pembahasan
a) Preparasi Ligan dan Reseptor
Tahap pertama
dalam penelitian ini yaitu dilakukannya
preparasi struktur molekul, dimana reseptor estrogen beta (ERβ) diunduh
pada website rscb.org (Protein Data
Bank) dengan kode 3OLS. Kemudian dilakukan penghapusan molekul air agar tidak mengganggu proses validasi dan docking,
kemudian dipisahkan reseptor estrogen beta (ERβ) dengan
ligan alaminya agar mempermudah
proses docking.
Tabel 1
Hasil Preparasi Makromolekul
|
Reseptor |
Kode |
Struktur 3 Dimensi |
|
Reseptor Estrogen Beta
(ERβ) |
3OLS |
|
Selanjutnya yaitu
preparasi ligan yang dimana
senyawa uji yaitu
bisphenol-A dan phloroglucinol dilakukan optimasi geometri agar mendapatkan konformasi� molekul
yang stabil dan memiliki energi potensial yang rendah. Struktur molekul masing-masing senyawa diperbaiki muatannya dengan menambahkan muatan persial sebelum dilakukan docking. Optimasi ini dilakukan
menggunakan software Chem3D Pro 15.0.
Tabel 2
Hasil Optimasi Molekul
|
Senyawa |
Struktur 2 Dimensi |
Struktur 3 Dimensi |
|
Bisphenol-A |
4,4�- (propane-2,2-diyl) diphenol |
|
|
Phloroglucinol |
|
|
b) Validasi Metode Docking
Pada proses validasi ini dilakukan
dengan cara kalkulasi Rate Mean
Square Deviation (RMSD).� Proses ini bertujuan untuk
memperoleh metode yang cocok untuk simulasi
docking senyawa
uji. Di mana reseptor estrogen beta (ERβ)
akan dipilih sebagai senyawa alaminya untuk dilakukan proses docking.
Nilai RMSD yang dapat diterima
adalah kurang dari 2 Angstroms (< 2�), sehingga
memperlihatkan bahwa metode docking
yang dipakai dapat menghasilkan simpangan yang tidak terlalu besar �Adapun parameter validasi
metode docking
yaitu ukuran grid box, jumlah
run, dan maximum number of evals (short,
medium, atau
long).
c)
Ukuran Grid Box
Ukuran grid box yang digunakan pada proses validasi metode docking harus dapat menutupi seluruh bagian senyawa ligan alami dan ligan uji
agar diperoleh hasil yang baik. Dilakukan autogrid dengan ukuran grid box (40x40x40) menggunakan
software MGL Tools versi 1.5.6 dengan dilengkapi Autodock Tools versi 4.2.6 sehingga didapat hasil sebagai
berikut:
Tabel 3
Ukuran Grid Box, Grid Center dan Spasing
(Angstrom)
Berdasarkan Tabel
3. ukuran grid
box (40x40x40) didapat ukuran
grid center yaitu
pada koordinat (x,y,z)
26.647; -23.692; -10.814 dan spasing 0.375 �. Koordinat� tersebut nantinya akan digunakan
dalam simulasi docking senyawa
uji.
d) Simulasi Hasil Docking
Tahap selanjutnya
yaitu dilakukan simulasi hasil docking antara
senyawa bisphenol-A
dan phloroglucinol terhadap reseptor estrogen beta
(ERβ) dengan ukuran grid box dan koordinat
yang sama pada saat melakukan validasi metode docking. Simulasi docking ini dilakukan guna
melihat konformasi interaksi senyawa bisphenol-A dan phloroglucinol serta afinitas
pada sisi aktif reseptor estrogen beta (ERβ).
Simulasi docking dilakukan menggunakan
software MGL Tools versi 1.5.6 yang dilengkapi dengan Autodock Tools versi 4.2.6 didapat
hasil sebagai berikut:
Tabel 4
Simulasi Hasil Docking
Sementara interaksi
antara ligan dan reseptor hasil docking senyawa pembanding dan senyawa uji terbaik dalam bentuk dua
dimensi (2D) dan tiga dimensi (3D) sebagai berikut:
Gambar 4
Interaksi Senyawa Bisphenol-A Dan Phloroglucinol
Terhadap Reseptor Estrogen Beta (Erβ)
e)
Analisis Hasil Docking
Berdasarkan hasil
dari simulasi docking yang tertera
pada Tabel 4., energi bebas
ikatan (∆G) yang didapat
dari senyawa bisphenol-A sebesar
-7,70 Kcal/mol dan senyawa phloroglucinol sebesar -4,67 Kcal/mol. Dalam hal ini
menunjukan bahwa senyawa bisphenol-A
memiliki ikatan yang kuat terhadap reseptornya
dibandingkan phloroglucinol.
Semakin kecil nilai energi bebas
ikatan (∆G) suatu senyawa, maka energi
interaksi semakin rendah dan ikatan terhadap reseptor akan semakin kuat,
sehingga dalam kasus ini senyawa
tersebut dinyatakan toksik dan sulit terurai dalam tubuh.
Sementara jika nilai energi bebas
ikatan (∆G) suatu senyawa tersebut lebih tinggi maka
energi interaksi akan semakin tinggi
juga sehingga ikatan antar senyawa dengan
reseptor akan sulit terbentuk dan akan mudah untuk
terurai oleh tubuh. Berdasarkan uraian di atas, dapat dipastikan
bahwa bisphenol-A
lebih toksik dari pada phloroglucinol.
Interaksi kontak
residu yang berikatan antara ligan dengan reseptor berdasarkan Gambar 4. dengan uraian
masing-masing residu yaitu interaksi antara senyawa bisphenol-A
berikatan dengan asam amino 305 GLU, 346 ARG, 343 LEU, 356 PHE, 339 LEU, 298
LEU, 302 ALA, 340 MET, 336 MET, 476 LEU (10 residu)
dan senyawa phloroglucinol
berikatan dengan asam amino 298 LEU, 343 LEU, 301 LEU, 339 LEU, 305 GLU, 356
PHE, 302 ALA (7 residu). Analisis
ikatan hidrogen dari hasil visualisasi
antara ligan dengan reseptor estrogen beta (Erβ),
dapat dilihat bahwa kedua senyawa
memiliki dua interaksi ikatan hidrogen yang ditandai dengan garis putus-putus berwarna hijau. Hal tersebut menunjukan bahwa kedua senyawa
uji yaitu bisphenol-A
dan phloroglucinol memiliki aktivitas yang baik dalam mengikat
hidrogen. Dengan demikian, dalam menentukan afinitas suatu senyawa berdasarkan
nilai terendah energi bebas ikatan
(ΔG) lebih diutamakan daripada jumlah ikatan hidrogen.
f)
Parameter Toksisitas
Tabel 5
Penelitian selanjutnya
dilakukan analisis toksisitas senyawa phloroglucinol
dan bisphenol-A menggunakan software Toxtree versi 3.1.0. Pada analisis toksisitas ini menggunakan 3 parameter yaitu, cramer rules, kroes TTC decision Tree, dan begigni/bossa
rulerbase. Cramer rules� adalah tingkatan toksisitas yang dinilai dari gugus
fungsi senyawa. Pada
parameter ini, senyawa
phloroglucinol masuk ke dalam kategori Low (Class I) yang
dimana senyawa
Phloroglucinol diprediksi memiliki
toksisitas yang sangat rendah
(aman), sedangkan pada senyawa bisphenol-A masuk ke dalam kategori
High (Class III) yang di mana artinya
senyawa bisphenol-A
memiliki potensi toksisitas yang tinggi.
Kroes TTC decision tree adalah parameter� yang�
memperkirakan�
ambang� batas paparan�� dari�� senyawa� uji�� terhadap�� manusia.� Jika�� dilihat� dari� hasil� pada� Tabel V.5, senyawa phloroglucinol dan bisphenol-A masih berada
di ambang batas paparan akan tetapi
dengan resiko paparan yang masih rendah.
Selanjutnya parameter begigni/bossa rulerbase
adalah parameter yang memperlihatkan
apakah senyawa uji dapat menyebabkan karsinogenik dan mutagenisitas. Berdasarkan hasil yang dapat dilihat pada Tabel 5., senyawa
phloroglucinol dan bisphenol-A menunjukan
hasil negatif dan tidak dapat menyebabkan
karsinogenik dan mutagenisitas.
Kesimpulan
Penelitian ini
telah berhasil dilakukan uji in
silico guna melihat afinitas dari senyawa
phloroglucinol dan bisphenol-A terhadap
reseptor estrogen beta (ERβ). Berdasarkan hasil simulasi docking menunjukan bahwa nilai energi bebas
ikatan (∆G) phloroglucinol
terhadap reseptor estrogen
beta (ERβ) sebesar -4,67 Kcal/mol dan bisphenol-A terhadap
reseptor estrogen beta (ERβ) sebesar
-7,70 Kcal/mol. Hasil tersebut menunjukkan
bahwa senyawa phloroglucinol memiliki
afinitas yang lebih kecil dari pada bisphenol-A terhadap
reseptor estrogen beta (ERβ), juga hasil dari parameter cramer rules yang menunjukkan
bahwa senyawa phloroglucinol masuk
ke dalam kategori Low (Class I) dibandingkan
dengan bisphenol-A
yang masuk ke dalam kategori High (Class III).
Berdasarkan hasil
dari dua pengujian tersebut, dapat disimpulkan bahwa senyawa phloroglucinol memiliki
tingkat keamanan yang lebih tinggi dibandingkan
bisphenol-A, sehingga
senyawa phloroglucinol
dapat dilakukan pengujian toksisitas in vivo di laboratorium
guna mendapatkan hasil yang lebih akurat sebagai alternatif bahan baku plastik yang aman bagi kesehatan
khususnya terhadap kaum wanita.
Dwipratama, Gisantya Nuansa, & Effendi, Diar
Herawati. (2017). Perbandingan Uji Afinitas Reseptor Estrogen terhadap
Bisphenol-A dan Phloroglucinol dari Sargassum duplicatum dengan Metode In
silico. Prosiding Farmasi, 53�60.
Foloppe, Nicolas, & Chen, I. Jen.
(2009). Conformational sampling and energetics of drug-like molecules. Current
Medicinal Chemistry, 16(26), 3381�3413.
Kesuma, Dini, Purwanto, Bambang Tri, &
Hardjono, Suko. (2018). Uji in silico aktivitas sitotoksik dan toksisitas
senyawa Turunan N-(Benzoil)-N�-feniltiourea sebagai calon obat antikanker. Journal
of Pharmaceutical Science and Clinical Research, 3(1), 1�11.
Kim, Se Kwon. (2014). Handbook of anticancer
drugs from marine origin. Springer.
Lazennec, Gwendal, Bresson, Damien, Lucas,
Annick, Chauveau, Corine, & Vignon, Fran�oise. (2001). ERβ inhibits
proliferation and invasion of breast cancer cells. Endocrinology, 142(9),
4120�4130.
Le, Hoa H., Carlson, Emily M., Chua, Jason
P., & Belcher, Scott M. (2008). Bisphenol A is released from polycarbonate
drinking bottles and mimics the neurotoxic actions of estrogen in developing
cerebellar neurons. Toxicology Letters, 176(2), 149�156.
Maryawan, Irman, Effendi, Diar Herawati,
& Fakih, Taufik Muhammad. (2020). Uji In Silico Reaktivitas Reseptor NMDA
(N-Metil-D-Aspartat) Ensefalitis terhadap Hidroksiprolin. Prosiding Farmasi,
6(2), 872�878.
Motiejunas, D., & Wade, R. C. (2007). Structural,
energetic, and dynamic aspects of ligand�receptor interactions.
Mulyani, Nina Siti. (2013). Menopause akhir
siklus menstruasi pada wanita di usia pertengahan. Yogyakarta: Nuha Medika,
10.
Samee, Haider, Li, Zhen xing, Lin, Hong,
Khalid, Jamil, & Guo, Yong chao. (2009). Anti-allergic effects of ethanol
extracts from brown seaweeds. Journal of Zhejiang University Science B, 10(2),
147�153.
Schneider, Gisbert, & Baringhaus, Karl
Heinz. (2008). Molecular design: concepts and applications.
Stiger-Pouvreau, Val�rie, Jegou, Camille,
Cerantola, St�phane, Gu�rard, Fabienne, & Le Lann, Klervi. (2014).
Phlorotannins in Sargassaceae species from Brittany (France): Interesting
molecules for ecophysiological and valorisation purposes. In Advances in
botanical research (Vol. 71, pp. 379�411). Elsevier.
|
Copyright holder: Diar Herawati, A.A Hidayat, Amir Musadad (2022) |
|
First publication right: Syntax Literate: Jurnal Ilmiah
Indonesia |
|
This article is licensed
under: |